如何選擇適合的高效液相色譜柱？

瀏覽： 1615| 更新時(shí)間：2025-12-27 |

選擇適合的高效液相色譜（HPLC）柱是確保分離效果、分析精度和實(shí)驗(yàn)效率的核心環(huán)節(jié)，需結(jié)合樣品特性、分離目標(biāo)、儀器條件和實(shí)際應(yīng)用場景四大維度，遵循“先定分離模式，再選柱參數(shù)，最后優(yōu)化適配”的邏輯進(jìn)行系統(tǒng)化選型，以下是具體的選型方法和實(shí)操要點(diǎn)：

一、明確分離模式：根據(jù)樣品性質(zhì)選擇核心色譜類型

高效液相色譜的分離模式?jīng)Q定了色譜柱的核心分離原理，需根據(jù)樣品的極性、分子量、電荷特性等關(guān)鍵性質(zhì)選擇適配的分離模式，這是色譜柱選型的第一步。

反相色譜（RP-HPLC）這是很常用的分離模式，適用于絕大多數(shù)非極性至中等極性的有機(jī)化合物，如藥物、農(nóng)藥、食品添加劑、環(huán)境污染物等。其分離原理基于樣品中各組分與非極性固定相（如C18、C8）的疏水相互作用差異，極性越強(qiáng)的組分越先洗脫，極性越弱的組分保留時(shí)間越長。若樣品為中性或弱極性有機(jī)物，優(yōu)先選擇反相色譜柱，這是通用性很強(qiáng)的分離模式，實(shí)驗(yàn)條件易優(yōu)化，重現(xiàn)性好。

正相色譜（NP-HPLC）適用于分離極性較強(qiáng)的化合物，如糖類、氨基酸、維生素、極性藥物中間體等。分離原理基于樣品組分與極性固定相（如硅膠、氨基柱、氰基柱）的極性相互作用（氫鍵、dipole-dipole作用），極性越弱的組分越先洗脫，極性越強(qiáng)的組分保留時(shí)間越長。若樣品極性強(qiáng)、在反相色譜中保留過強(qiáng)或分離效果差，可選擇正相色譜柱，尤其適合異構(gòu)體分離。

離子交換色譜（IEC）適用于分離離子型化合物或可電離的化合物，如有機(jī)酸、生物堿、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等。分離原理基于樣品離子與固定相表面的離子交換基團(tuán)發(fā)生可逆的離子交換反應(yīng)，根據(jù)離子電荷數(shù)和離子半徑的差異實(shí)現(xiàn)分離。若樣品為帶電物質(zhì)，需選擇對應(yīng)的離子交換色譜柱（陽離子交換柱用于分離帶正電的組分，陰離子交換柱用于分離帶負(fù)電的組分）。

體積排阻色譜（SEC）適用于分離大分子化合物，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖、聚合物等，主要用于測定分子量分布和純度檢測。分離原理基于樣品分子的尺寸差異，小分子可進(jìn)入固定相的孔道，保留時(shí)間長；大分子無法進(jìn)入孔道，直接被洗脫，保留時(shí)間短。若樣品為大分子物質(zhì)，且需按分子量大小分離，選擇體積排阻色譜柱，避免大分子在其他色譜柱中吸附或降解。

二、細(xì)化色譜柱參數(shù)：匹配分離需求與儀器條件

確定分離模式后，需進(jìn)一步選擇色譜柱的關(guān)鍵參數(shù)，包括固定相、柱尺寸、粒徑、孔徑等，這些參數(shù)直接影響分離效率、分析速度和檢測靈敏度。

（一）固定相選擇：核心分離性能的決定性因素

反相色譜柱固定相

C18（十八烷基硅烷）：應(yīng)用很廣泛的固定相，疏水性強(qiáng)，適合分離絕大多數(shù)非極性和中等極性化合物，如藥物、環(huán)境污染物、食品添加劑等，通用性強(qiáng)，穩(wěn)定性好。

C8（辛烷基硅烷）：疏水性弱于C18，適合分離極性稍強(qiáng)的化合物，或在C18柱上保留過強(qiáng)的樣品，可縮短保留時(shí)間，提高分析效率。

苯基柱：除疏水作用外，還存在π-π相互作用，適合分離含有苯環(huán)、共軛雙鍵等芳香族化合物，能提供與C18不同的選擇性，改善異構(gòu)體分離效果。

極性嵌入相柱：在烷基鏈中嵌入極性基團(tuán)（如氨基、酰胺基），適合分離極性化合物，同時(shí)兼容100%水相流動相，避免疏水塌陷。

正相色譜柱固定相

硅膠柱：極性很強(qiáng)的固定相，適合分離強(qiáng)極性化合物，如糖類、有機(jī)酸等，但需注意流動相含水量，含水量過高會導(dǎo)致保留時(shí)間漂移。

氨基柱（-NH?）：適合分離糖類、核苷類化合物，同時(shí)也可作為反相或離子交換柱使用，通用性較強(qiáng)。

氰基柱（-CN）：極性弱于硅膠和氨基柱，適合分離中等極性化合物，能提供獨(dú)特的選擇性，尤其適合異構(gòu)體分離。

離子交換色譜柱固定相

陽離子交換柱：固定相帶有磺酸基（-SO?H）、羧基（-COOH）等酸性基團(tuán)，用于分離陽離子（如金屬離子、生物堿），其中磺酸基為強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)，適用pH范圍廣；羧基為弱陽離子交換基團(tuán)，適合分離弱酸堿性化合物。

陰離子交換柱：固定相帶有季銨基（-N(CH?)??）等堿性基團(tuán)，用于分離陰離子（如有機(jī)酸、核酸），季銨基為強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)，穩(wěn)定性好，適用pH范圍廣。

（二）柱尺寸選擇：平衡分離效率與分析速度

常規(guī)分析柱：長度150-250mm，內(nèi)徑4.6mm，這是很常用的柱尺寸，分離效率高，適合絕大多數(shù)常規(guī)分析，能滿足復(fù)雜樣品的分離需求，但分析時(shí)間較長，流動相消耗量大。

快速分析柱：長度50-100mm，內(nèi)徑2.1-4.6mm，分離效率略低于常規(guī)柱，但分析時(shí)間可縮短50%以上，流動相消耗量減少，適合高通量分析或快速篩查實(shí)驗(yàn)。

微徑柱（窄徑柱）：內(nèi)徑2.1mm，長度100-150mm，分離效率與常規(guī)柱相當(dāng)，但流動相消耗量僅為常規(guī)柱的1/5-1/10，適合與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用，減少流動相對質(zhì)譜離子源的污染，同時(shí)提高檢測靈敏度。

制備柱：內(nèi)徑大于10mm，長度150-250mm，柱容量大，適合樣品制備和純化，用于從混合物中分離純化目標(biāo)化合物。

（三）填料粒徑與孔徑：優(yōu)化分離效率與樣品兼容性

填料粒徑：常見粒徑有1.8μm、3μm、5μm等，粒徑越小，柱效越高，分離效果越好，但柱壓也越高，對儀器的耐壓要求也越高。

5μm粒徑：常規(guī)分析的選擇，柱壓適中（約10-20MPa），分離效率滿足常規(guī)需求，對儀器要求較低，使用壽命長。

3μm粒徑：柱效高于5μm，適合復(fù)雜樣品的分離，柱壓略高（約20-30MPa），需配備高壓液相色譜儀。

1.8μm粒徑：超高效液相色譜（UPLC）專用，柱效很高，分離速度快，但柱壓高達(dá)40-60MPa，需使用耐高壓的UPLC系統(tǒng)。

填料孔徑：孔徑大小決定了樣品分子能否進(jìn)入固定相內(nèi)部，直接影響保留和分離效果。

常規(guī)孔徑（80-120Å）：適合分離小分子化合物（分子量＜1000），如藥物、農(nóng)藥、有機(jī)酸等，是很常用的孔徑規(guī)格。

大孔徑（300Å及以上）：適合分離大分子化合物（分子量＞1000），如蛋白質(zhì)、多肽、聚合物等，避免大分子無法進(jìn)入孔道而導(dǎo)致無保留或分離效果差。

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